如何选择合适的液相色谱柱
怎样挑选色谱柱
现代液相色谱中,分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的挑选。可是色谱填料的挑选规模很宽,要做适宜的挑选,有必要对此有一定的认识和了解。
1、正相色谱
正相色谱用的固定相一般为硅胶(Silica),以及其他具有极性官能团,如胺基团(NH2,APS)和氰基团(CN,CPS)的键合相填料。因为硅胶外表的硅羟基(SiOH)或其他团的极性较强,因而,分离的次序是依据样品中的各组份的极性巨细,即极性强弱的组份被冲刷谱柱。正相色谱运用的活动相极性相比照固定相低,如:正乙烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(Methylene Chloride)等。
2、反相色谱
反相色谱填料常是以硅胶为基础,外表键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所运用的活动相极性较强,一般为水,缓冲液与甲醇,已腈等混合物。样品流谱柱的次序是极性较强组合被冲出,而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保存。常用的反相填料有C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)等。
二、聚合物填料
聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等,其主要优点是在PH值为1~14均可运用。相对与硅胶基质的C18填料,这类填料具有更强的疏水性;大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常。现在的聚合物填料的缺陷是相对硅胶基质填料,色谱柱柱效较低。
三、其他无机填料
其它HPLC的无机填料色谱柱也现已商品化。因为其特别的性质,一般于特别的用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相,石墨化碳的外表即是保存的基础,不再需其它的外表改性,该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保存才能更强,石墨化碳可用于分离某些几何导构体,又因为HPLC活动相中不会被溶解,这类柱可在任何PH与温度下运用。氧化铝也可用于HPLC,氧化铝微粒刚性强,可制成安稳的色谱柱柱床,其优点是可在PH高达12的活动相中运用。但因为氧化铝与碱性化合物作用也很强,运用规模遭到一定的限制,所以未能广泛运用,新式氧化锆填料也可用于HPLC,商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱,运用PH规模1~14,温度可达100℃。因为氧化锆填料几年才开始研讨,加之面临的试验难度,其重要用途与优势尚在进行中。
怎样挑选填料粒度
现在,商品化的色谱料粒度从1um到超越30um均有出售,而现在剖析分离主要用3um、5um和10um填料,填料的粒度主要影响填充柱的两个参数,即柱效和背压。粒度越小,填充柱的柱效越高;小于3um的填料运用,在相同挑选性条件下,提高柱效可提高分离度,但不是的要素。假如固定相挑选是正确,可是分离度不够,那么挑选更小粒度的填料是很有用的,3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%;但是,3um的色相谱的背压却是5um的2倍。与此同时,柱效提高意味着在相同条件下可以挑选更短的色谱柱,以缩短剖析时间,另外,可以采用低粘度的溶剂做活动相或添加色谱柱的运用温度,比如用乙腈替代甲醇,以下降色谱柱的压力。
一、怎么杰出的柱性能与柱寿数
◆ 认证阅读色谱柱运用说明书;
◆ 运用填充杰出的色谱柱;
◆ 尽量削减压力波动,防止机械及热冲击;
◆ 运用维护柱及在线过滤器;
◆ 经常以强溶剂冲刷色谱柱;
◆ 充分过滤样品及活动相,尽量防止杂质微粒与强保存成分;
◆ 用安稳的固定相(C18*安稳);
◆ 在中等PH值操作(6~8),用有机缓冲溶液;
◆ 色谱柱运用温度小于40℃;
◆ 硅胶基质的的色谱柱,应保持活动相的PH值规模在3.0~8.0;
◆ 在水活动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠;
◆ 活动相中含有缓冲溶液,应注意应95∶5的水及有机溶剂过渡,有机溶剂不能低于5%;
◆ 过夜或贮存时,冲刷掉盐和缓冲液,用纯有机溶剂活动相保存(乙晴)。
HPLC固定相及应用范围
名称 别名 功能基团 正相 反相 离子对 应用 |
Silica -OH √ 非极性和中等极性以及非离子性有机化合物。 |
SAS C1 -(CH3)3 √ 在所有的烷基键合相中对非极性化合物保留* 弱,典型用于中等极性和多官能团化合物. |
Butyl C4 -C4H9 √ √ 分离肽和蛋白质,保留时间比C8和C18短。 |
MOS C8, -C8H17 √ √ 中等极性相中对中等化合物,小肽和蛋白质, Octyl 极性药族化合物和环境样品。 |
ODS C18 -C18H37 √ √ 烷基键合相中对中等极性化合物保留*强。广 泛用于药物,甾族化合物,脂肪酸和环境样品. |
CPS CN ,Cyano -(CH2)3CN √ √ 对极性化合物有独特的选择性,适合应用于正相 (propyl 分离,当用于反相系统时,其选择性与 C8和 Nitrile) C18不同,在药学领域和复杂混合物的分离中应 用广泛。 |
APS NH2 -(CH2)3 NH2 √ √ 反相中分析糖类和其他极性化合物。弱阴离子交 (Amino Propyl) 换 ,阴离子和有机酸则应用缓冲剂和有机改性 剂 做流动相。正相中与硅胶的选择性机改性剂 不同,分析芳香族效果很好。 |
Phenyl -(CH3)C6H5 √ √ 芳香族化合物 |
Diol -(CH2)2O √ √ 反相时,分离肽和蛋白质。正相时,与硅选择 CH2(CH2OH)2 性 相似,但极性较弱。 |
SCX 强阳离子 -(CH2)2C6H4SO3H- √ 有机碱 交换 |
SAX 强阴离子 -(CH2)3N+(CH3)3 有机酸,核苷和核苷酸 交换 |
二、如何解决色谱柱使用过程中出现的问题
1.保留值与分离度重现性不好原因分析
问题 原因 表现 |
不同色谱柱间差异 填料、键合相不同 保留因子(k),分离因子(α) 使用期间柱变化 柱床破坏 柱效(N) 键合相丢失 保留因子(k),分离子(α) 硅胶基质溶解 柱效(N) 强保留分堆积堵塞 保留因子(k),柱效(N) |
柱外效应 系统差异,进样量大、 柱效(N) 进样阀与 色谱柱之间、 色谱柱与检测器之间管 路太长、检测器流通池 体积大、接头死体积大 等。 |
分离效果变差 流动相组分改变 保留因子(k),柱效变化很小 流速改变 保留因子(k),分离因子(α) 温度改变 保留因子(k),柱效变化很小 |
柱平衡慢 重新平衡时间不够 保留因子(k),柱效变化很小 |
柱超载 样品量太大 保留因子(k),柱效(N) |
2.造成色谱峰(不对称)拖尾的原因
1.色谱柱本身填装问题,筛板堵塞或填料塌陷;
2.柱头有污染;
3样品超载;
4样品溶剂不合适;
5.柱外效应;
6化学或二次保留(硅羟基)效应;
7缓冲容量不足或不合适;
8重金属污染。
3.如何解决峰形拖尾的问题
A.与化学有关的拖尾问题
1.流动相中,加入30mM的三乙胺(用与碱性化合物)或醋酸胺(用与酸性化合物),未知化合物加醋酸三乙胺;
2.如仍然拖尾,将三乙胺换为二甲基辛胺(或醋酸二甲基辛胺);
3.降低进样量至<1ug。
B.与色谱柱有关的拖尾问题
1.如柱头处有强保留的样品组分积聚,反相柱可用20倍柱体积的96%的二碌甲烷与4%甲醇,加1%氢氧化铵混合液冲洗,正向柱可用甲醇冲洗。
2.使用保护柱
C.与HPLC 系统有关的峰拖尾和峰加宽
1.进样体积过大,(通常≤25uL);
2.进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大(连接管应<20cm,内径为0.007″);
3.检测器流通池的体积过大。
4.如何储存色谱柱
1.防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物,做到流动相用多少配多少,或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制细菌成长(一定当心其毒性和潜在的爆炸性);或在流动相中加20%的有机改性剂,也可抑制微生物生长,有机改性剂还有助于流动相脱气。
2.尽可能将色谱柱贮存于100%有机溶剂(乙晴)中,避免在缓冲溶液中保存。
3.使用缓冲溶液后的色谱柱,应用15~20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水—有机溶剂流动相冲洗色谱柱,后换成100%有机溶剂储存。
4.避免用纯净水冲洗键合致密的C18柱。
5.将色谱柱的两端用堵头拧好,以免柱床填料干裂。
如何选择保护柱
怎样选择保护柱,但又不能影响分离分析?这是色谱工作者经常提出的一个问题。通常,在选择保护柱之前首先要考虑的是样品是否清洁。对于大部分分析工作者来说,一只1cm长的保护柱,那么就应选择2cm或3cm长的保护柱。保护柱越长,自然所装填的色谱填料就越多,则其越能避免污染物进入分析色谱柱的机会。当然,随着保护柱的长度加长,样品的保留时间会比使用短保护柱长。
一般来说,保护柱的内径与分析色谱柱的内径相同或相当即可。保护柱的填料装填方式也很重要。目前有薄膜装填法的保护柱,使用过程很简单方便,而且可以在实验室中进行干装。但是,其的缺点是不经济,特别是针对中国的具体情况,一次性使用相对费用较高。另外,薄膜装填法的保护柱所装填的色谱填料有限,只能提供有限的保护作用;不过也因为所装填的色谱料较少,保护柱的长度也较短,所以对分析样品的保留时间的影响也很小。
另一种保护柱结构其实质是缩短了的色谱分析拄,设计方式上有直连式、手紧式或整体式。整体式设计是由色谱的生产厂商直接安装在色谱分析柱上的,必须与色谱分析柱一同订货,可以非常方便地使用,但不能够被修改。直连式结构设计可在任何时候有色谱工作者来安装连接,可以与任何品牌的色谱分析柱连接使用,而且还可以根据样品的相关情况选择不同的保护柱长度。手上紧即可。
另外从保护柱结构又分为是否可以更换保护柱柱芯。可以降低保护柱的使用成本。大多数人是根据色谱分析柱的填料选择保护柱的填料,正常情况下可以选择与分析色谱柱一样的色谱填料。但是,根据实际的分析工作,也可不必与分析色谱柱的填料相匹配。对于选择保护柱的原则是:在满足分析分离要求的前提条件下,尽可能的选择较短的保护柱结构,尽可能选择对分离样品小一些保留性的填料。
仪器的主要功能和应用:
LC600A 高效液相色谱仪
LC600A 高效智能全控液相色谱仪由 P600 高压恒流泵与 UV600 紫外检测器直接构成等度 / 梯度分析系统。使用 WS600 工作站可以同时控制数台 P600 高压恒流泵、UV600 紫外检测器及恒温柱箱等,实行多元高压洗脱、波长扫描等功能。
特点:
✦LC-P600高压恒流泵
(1)往复式并联泵设计,流量精度高,压力脉动小,延长密封圈和 活塞杆的使用寿命;
(2)隔膜式秒冲阻尼器与电子脉动抑制技术同时控制压力脉动保障 最低的基线噪音;
(3)整体性单向阀,结构简单,密封性好;
(4)柱塞杆自动缩进,方便更换密封圈;
(5)可选配注后清洗功能,适用于使用含缓冲盐的分析条件。
✦UV600紫外检测器
(1)平行双锥孔设计的流动池,大幅提高信噪比,检测效果更佳;
(2)开机自检功能,通过图谱上486.6nm和656nm这二点的位置, 以判断波长示值误差的准确性,保证极优的波长精度,保障仪器最佳状态;
(3)控制电路采用多微处理器结构,分别管理信号采集、数据处理、 系统控制和通信。在做等度分析时,可以方便的通过全汉字的液晶屏与七 个功能键,设置波长、滤波常数、输出量程、运行时间等参数。并且可以 实现开关氘灯,光谱扫描,启动分析程序等功能;
(4)全数字交换系统,避免了色谱信号需要多重模-数转换带来的 信号畸变与干扰。
✦WS600色谱工作站
(1)具有液相色谱系统控制和色谱数据处理双重功能;
(2)六种定量计算方法;
(3)多重不同浓度的标准试样校准运行,建立样品浓度-面积校正曲线;
(4)灵活的峰识别和处理能力;
(5)色谱图形、定量计算方式、峰处理参数及峰鉴定表等可保存到用户自命名的文件中。
✦具有自动在线检测功能
液相色谱原理:储液器中的流动相由高压泵泵入系统,样品溶液通过注射器进入流动相,流动相装柱(固定相)。由于样品溶液中的组分在两相中的分配系数不同,当它们相对运动时,会经历重复的时间。在吸附-解吸分配过程中,各组分的移动速度差异很大。它被分离成单一组分,依次流出色谱柱。当通过检测器时,样品浓度被转换成电信号并传输到记录仪。这些数据可以用图表的形式打印出来,供研究人员分析。
丨关于南京科捷
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