食品安全国家标准-食品中脂肪酸的测定 GB5009.168—2016
食品安全国家标准
食品中脂肪酸的测定
GB5009.168—2016
概述
脂肪酸介绍
• 大部构成食物的脂肪和动物体脂主要以甘油三酯为其基本结构， 甘油三脂实质上就是一分子甘油与三分子脂肪酸所形成的酯， 构成三个分子脂肪酸的种类很多， 目前已知存在于自然界的脂肪酸有40多种。
• 脂肪酸的命名和表示方式可以简化为碳的数目与不饱和键的数目， 例如棕榈酸为16个碳的饱和脂肪酸， 其中没有不饱和键，故以16：0表示，而油酸含有18个碳和一个不饱和键（一个烯），以18∶1表示，故棕榈酸的式列应为：
• 16 4 3 2 1
• CH3[CH2]11·CH2·CH2·CH2·COOH
• ω g b a
• 脂肪酸碳原子位置的排列名称也统一为上述的分子式
前言
本标准代替GB/T 5009.168—2003《食品中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的测定》 、 GB/T22223—2008《食品中总脂肪、 饱和脂肪(酸)、 不饱和脂肪(酸)的测定 水解提取-气相色谱法》 、 GB5413.27—2010《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定》 、GB/T9695.2—2008《肉与肉制品 脂肪酸测定》 、GB/T17376—2008《动植物油脂 脂肪酸甲酯制备》 、GB/T17377—2008《动植物油脂 脂肪酸甲酯的气相色谱分析》 、 SN/T2922—2011《出口食品中EPA 和DHA 的测定 气相色谱法》 、 NY/T91—1988《油菜籽中油的芥酸的测定 气相色谱法》 。
• 本标准与GB/T5009.168—2003相比,主要变化如下:
Ø —标准名称修改为“食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定”
Ø —增加了内标法和归一化法
Ø —修改了原标准中的色谱柱,将玻璃柱改为毛细管色谱柱
1 范围
• 本标准规定了食品中脂肪酸含量的测定方法
• 本标准适用于食品中总脂肪、 饱和脂肪(酸)、不饱和脂肪(酸)的测定；
Ø本标准中水解-提取法适用于食品中脂肪酸含量的测定；
Ø酯交换法适用于游离脂肪酸含量不大于2%的油脂样品的脂肪酸含量测定；
Ø乙酰氯-甲醇法适用于含水量小于5%的乳粉和无水奶油样品的脂肪酸含量测定。
第一法 内标法
• 2 原理
• 2.1 水解-提取法
Ø 加入内标物的试样经水解-乙醚溶液提取其中的脂肪后,在碱性条件下皂化和甲酯化,生成脂肪酸甲酯,经毛细管柱气相色谱分析,内标法定量测定脂肪酸甲酯含量。
Ø 依据各种脂肪酸甲酯含量和转换系数计算出总脂肪、 饱和脂肪(酸)、 单不饱和脂肪(酸)、 多不饱和脂肪(酸)含量。动植物油脂试样不经脂肪提取,加入内标物后直接进行皂化和脂肪酸甲酯化。
• 2.2 酯交换法(适用于游离脂肪酸含量不大于2%的油脂):将油脂溶解在异辛烷中,加入内标物后,加入氢氧化钾甲醇溶液通过酯交换甲酯化，反应完全后,用硫酸氢钠中和剩余氢氧化钾,以避免甲酯皂化。
3 主要试剂和材料
• 3.1.3 焦性没食子酸(C6H6O3)。
• 3.1.4 乙醚(C 4 H 10 O)。
• 3.1.5 石油醚:沸程30℃~60℃；
• 3.1.10 三氟化硼甲醇溶液,浓度为15%；
• 3.3.1 十一碳酸甘油三酯(C 36 H 68 O 6 ,CAS号:13552-80-2)；
• 3.2.1 盐酸溶液(8.3mol/L):量取250mL盐酸,用110mL水稀释,混匀,室温下可放置2个月；
• 3.2.2 乙醚-石油醚混合液(1+1):取等体积的乙醚和石油醚,混匀备用
• 3.2.3 氢氧化钠甲醇溶液(2%):取2g氢氧化钠溶解在100mL甲醇中,混匀；
• 3.2.4 饱和氯化钠溶液:称取360g氯化钠溶解于1.0L水中,搅拌溶解,澄清备用；
• 3.2.5 氢氧化钾甲醇溶液(2mol/L):将13.1g氢氧化钾溶于100mL无水甲醇中,可轻微加热,加入无水硫酸钠干燥,过滤,即得澄清溶液；
4 分析步骤
4.2 试样前处理
n 4.2.1 水解-提取法
• 4.2.1.1 试样的称取
Ø 称取均匀试样0.1g~10g(精确至0.1mg,约含脂肪100mg~200mg)移入到250mL平底烧瓶中,准确加入2.0mL十一碳酸甘油三酯内标溶液，加入约100mg焦性没食子酸,加入几粒沸石,再加入2mL95%乙醇和4mL水,混匀，根据试样的类别选取相应的水解方法,乳制品采用碱
水解法;乳酪采用酸碱水解法;动植物油脂直接进行。
步骤4.2.1.4;其余食品采用酸水解法
• 注:根据实际工作需要选择内标,对于组分不确定的试样,第一次检测时不应加内标物。 观察在内标物峰位置处是否有干扰峰出现,如果存在,可依次选择十三碳酸甘油三酯或十九碳酸甘油三酯或二十三碳酸甘油三酯作为内标；
4.2.1.2 试样的水解
• 酸水解法:
Ø 食品(除乳制品和乳酪):加入盐酸溶液10mL,混匀。 将烧瓶放入70℃~80 ℃水浴中水解40min。 每隔10min振荡一下烧瓶,使黏附在烧瓶壁上的颗粒物混入溶液中。 水解完成后,取出烧瓶冷却至室。温
• 碱水解法:
Ø 乳制品(乳粉及液态乳等试样):加入氨水5mL,混匀。 将烧瓶放入70℃~80℃水浴中水解20min。 每5min振荡一下烧瓶,使黏附在烧瓶壁上的颗粒物混入溶液中。水解完成后,取出烧瓶冷却至室温。
• 酸碱水解法:
Ø 乳酪:加入氨水5mL,混匀。 将烧瓶放入70 ℃~80 ℃水浴中水解20min。 每隔10min振荡一下烧瓶,使黏附在烧瓶壁上的颗粒物混入溶液中，接着加入盐酸10 mL,继续水解20min,每10min振荡一下烧瓶,使黏附在烧瓶壁上的颗粒物混入溶液中。 水解完成后,取出烧瓶冷却至室温。
4.2.1.3 脂肪提取
• 水解后的试样,加入10mL95%乙醇,混匀• 将烧瓶中的水解液转移到分液漏斗中,用
50mL乙醚石油醚混合液冲洗烧瓶和塞子,冲洗液并入分液漏斗中,加盖• 振摇5min,静置10min。 将醚层提取液收集到250mL烧瓶中。 按照以上步骤重复提取水解液3次,最后用乙醚石油醚混合液冲洗分液漏斗,并收集到250mL烧瓶中• 旋转蒸发仪浓缩至干,残留物为脂肪提取物。
4.2.1.4 脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化
• 在脂肪提取物中加入2%氢氧化钠甲醇溶液8mL,连接回流冷凝器,80℃±1℃水浴上回流,直至油滴消失，从回流冷凝器上端加入7mL15%三氟化硼甲醇溶液,在80 ℃±1 ℃水浴中继续回流2min，用少量水冲洗回流冷凝器，停止加热,从水浴上取下烧瓶,迅速冷却至室温；
• 准确加入10mL~30mL正庚烷,振摇2min,再加入饱和氯化钠水溶液,静置分层， 吸取上层正庚烷提取溶液大约5mL,至25mL试管中,加入大约3g~5g无水硫酸钠,振摇1min,静置5min，吸取上层溶液到进样瓶中待测定；
说明
• 目前标准中出现的甲酯化方法包括： 碱性条件下三氟化硼甲醇法， 三甲基氢氧化硫法， 盐酸甲醇法，其中GB/T 17376中规定的三种甲酯化方法是等同采用了ISO 5509： 2000《动植物油脂脂肪酸甲酯制备》 ， 其中三甲基氢氧化硫法的甲酯化反应是在进样口中， 于高温条件下进行， 不推荐使用极性固定相， 与本方法所采用的强极性固定相不匹配， 且在
国标中没有使用。 参考AOAC和AOCS中普遍使用三氟化硼酯化法， 少数国内标准方法中使用了盐酸甲醇法， 因此水解提取法中将甲酯化方法统一为应用较为普遍的三氟化硼-甲醇法。
4.2.2 酯交换法
• 适用于游离脂肪酸含量不大于2%的油脂样品
• 4.2.2.1 试样称取
Ø称取试样60.0mg至具塞试管中,精确至0.1mg,准确加入2.0mL内标溶液；
• 4.2.2.2 甲酯制备
Ø加入4mL异辛烷溶解试样,必要时可以微热使试样溶解后加入200μL氢氧化钾甲醇溶液,盖上玻璃塞猛烈振摇30s后静置至澄清，加入约1g硫酸氢钠,猛烈振摇,中和氢氧化钾，待盐沉淀后,将上层溶液移至上机瓶中,待测。
4.3.1 色谱参考条件
• 取单个脂肪酸甲酯标准溶液和脂肪酸甲酯混合标准溶液分别注入气相色谱仪,对色谱峰进行定性。
Ø a) 毛细管色谱柱:聚二氰丙基硅氧烷强极性固定相,柱长100m,内径0.25mm,膜厚0.2μm
Ø b) 进样器温度:270℃
Ø c) 氢火焰离子检测器检测器温度:280℃
Ø d) 程序升温:初始温度100℃,持续13min;100℃~180℃,升温速率10℃/min,保持6min;180℃~200℃,升温速率1℃/min,保持20min;200℃~230℃,升温速率4℃/min,保持10.5min。
Ø e) 载气:氮气
Ø f) 分流比:100∶ 1
Ø g) 进样体积:1.0μL
Ø h) 检测条件应满足理论塔板数(n)至少2000/m,分离度(R)至少1.25；
37种脂肪酸甲酯标准溶液典型参考图谱
1-37分别对应以下:1/C4:0,2/C6:0, 3/C8:0, 4/C10:0, 5/C11:0, 6/C12:0, 7/C13:0,8/C14:0, 9/C14:1, 10/C15:0,11/C15:1,12/C16:0,13/C16:1,15/C17:1,16/C18:0,17/C18:1n9t, 8/C18:1n9c,19/C18:2n6t, 20/C18:2n6c,21/C20:0,22/C18:3n6,23/C20:1,24/C18:3n3,25/C21:0,26/C20:2,27/C22:0,28/C20:3n6,29/C22:1n9,30/C20:3n3,31/C20:/1n6,32/C23:0,33/C22:2,34/C24:0,35/C20:5, 36/C24:1 ,37/C22: 6n3；
5.分析结果的表述
• 5.1 试样中单个脂肪酸甲酯含量
• 试样中单个脂肪酸甲酯含量按式(1)计算:
X i =F i ×（A i /A C11 ）×[ρC11×V C11×1.0067 /m]×100…………(1)
• 式中:
Ø X i —试样中脂肪酸甲酯i 含量,单位为克每百克(g/100g)；
Ø F i —脂肪酸甲酯i 的响应因子；
Ø A i —试样中脂肪酸甲酯i 的峰面积；
Ø A C11 —试样中加入的内标物十一碳酸甲酯峰面积；
Ø ρ C11 —十一碳酸甘油三酯浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL)；
Ø V C11 —试样中加入十一碳酸甘油三酯体积,单位为毫升(mL)；
Ø 1.0067—十一碳酸甘油三酯转化成十一碳酸甲酯的转换系数；
Ø m —试样的质量,单位为毫克(mg)；
Ø 100 —将含量转换为每100g试样中含量的系数；
5.2 试样中饱和脂肪(酸)含量
• 脂肪酸甲酯i 的响应因子Fi 按式(2)计算:
Fi =ρSi×A11/（ASi×ρ11）………………(2)
• 式中:
• F i —脂肪酸甲酯i 的响应因子；
• ρ Si —混标中各脂肪酸甲酯i 的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL)；
• A 11 —十一碳酸甲酯峰面积；
• A Si —脂肪酸甲酯i 的峰面积；
• ρ11———混标中十一碳酸甲酯浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL)；
第二法 外标法
6 原理
• 6.1 水解-提取法:试样经水解-乙醚溶液提取其中的脂肪后,在碱性条件下皂化和甲酯化,生成脂肪酸甲酯,经毛细管柱气相色谱分析,外标法定量测定脂肪酸的含量， 动植物纯油脂试样不经脂肪提取,直接进行皂化和脂肪酸甲酯化
• 6.2 乙酰氯-甲醇法(适用于含水量小于5%的乳粉和无水奶油试样):乙酰氯与甲醇反应得到的盐酸-甲醇使其中的脂肪和游离脂肪酸甲酯化,用甲苯提取后,经气相色谱仪分离检测,外标法定量
• 6.3 酯交换法(适用于游离脂肪酸含量不大于2%的油脂):将油脂溶解在异辛烷中,加入氢氧化钾甲醇溶液通过酯交换甲酯化,反应完全后,用硫酸氢钠中和剩余氢氧化钾,外标法定量测定脂肪酸的含量。
7 主要试剂和材料
• 7.2.1 盐酸溶液(8.3mol/L):同3.2.1
• 7.2.2 乙醚-石油醚混合液(1+1):同3.2.2
• 7.2.3 氢氧化钠甲醇溶液(2%):同3.2.3
• 7.2.4 饱和氯化钠溶液:同3.2.4
• 7.2.5 乙酰氯甲醇溶液(体积分数为10%):量取40 mL甲醇于100 mL 干燥的烧杯中,准确吸取5.0mL乙酰氯逐滴缓慢加入,不断搅拌,冷却至室温后转移并定容至50mL干燥的容量瓶中。 临用前配制。
Ø 注:乙酰氯为刺激性试剂,配制乙酰氯甲醇溶液时应不断搅拌防止喷溅,注意防护
• 7.2.6 碳酸钠溶液(6%):称取6g无水碳酸钠于100mL烧杯中,加水溶解,转移并用水定容至100mL容量瓶中；
• 7.2.7 氢氧化钾甲醇溶液(2mol/L):同3.2.5
8 仪器设备
• 8.1 匀浆机或实验室用组织粉碎机或研磨机；
• 8.2 气相色谱仪:具有氢火焰离子检测器(FID)；
• 8.3 毛细管色谱柱:聚二氰丙基硅氧烷强极性固定相,柱长100m,内径0.25mm,膜厚0.2μm；
• 8.4 恒温水浴:控温范围40℃~100℃,控温±1℃；
• 8.5 分析天平:感量0.1mg；
• 8.6 离心机:转速≥5000r/min；
• 8.7 旋转蒸发仪；
• 8.8 螺口玻璃管(带有聚四氟乙烯做内垫的螺口盖):15mL；
9.2 试样前处理
9.2.1 水解-提取法
• 9.2.1.1 试样的称取
Ø 称取均匀试样0.1g~10g(精确至0.1mg,约含脂肪100mg~200mg)移入到250mL平底烧瓶中,加入约100mg焦性没食子酸,加入几粒沸石,再加入2mL95%乙醇,混匀。 根据试样的类别选取不同的水解方法。
• 9.2.1.2 试样的水解
Ø 操作步骤同4.2.1.2
• 9.2.1.3 脂肪提取
Ø 操作步骤同4.2.1.3
• 10.2.1.4 脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化
Ø 操作步骤同4.2.1.4
Ø 动植物油脂试样不经脂肪提取,直接进行皂化和脂肪酸甲酯化(同4.2.1.4)
9.2.2 乙酰氯-甲醇法
• 9.2.2.1 试样称取
Ø 准确称取乳粉试样0.5g或无水奶油试样0.2g(均精确到0.1mg)于15mL干燥螺口玻璃管中,加入5.0mL甲苯；
• 9.2.2.2 试样测定液的制备
Ø 向试样中加入10%乙酰氯甲醇溶液6mL,充氮气后,旋紧螺旋盖，振荡混合后于80℃±1℃水浴中放置2h,期间每隔20min取出振摇1次,水浴后取出冷却至室温，将反应后的样液转移至50mL离心管中,分别用3 mL碳酸钠溶液清洗玻璃管3 次,合并碳酸钠溶液于50 mL离心管中,混匀。 5000r/min离心5minØ 取上清液作为试液,气相色谱仪测定；
9.2.3 酯交换法
• 9.2.3.1 试样称取
Ø称取试样60.0mg至具塞试管中,精确至0.1mg；
• 9.2.3.2 甲酯制备
Ø同4.2.2.2
第三法 归一化法
• 10 原理
• 10.1 水解-提取法:试样经水解-乙醚溶液提取其中的脂肪后,在碱性条件下皂化和甲酯化,生成脂肪酸甲酯,经毛细管柱气相色谱分析,面积归一化法定量测定脂肪酸百分含量， 动植物油脂试样不经脂肪提取,直接进行皂化和脂肪酸甲酯化；
• 10.2 酯交换法(适用于游离脂肪酸含量不大于2%的油脂):将油脂试样溶解在异辛烷中,加入氢氧化钾甲醇溶液通过酯交换甲酯化,反应完全后,用硫酸氢钠中和剩余氢氧化钾,面积归一化法定量测定脂肪酸百分含量。
11 分析步骤
• 11.1 试样的制备
Ø 操作步骤同4.1
• 11.2 水解-提取法
• 11.2.1 试样的称取
Ø 称取均匀试样0.1g~10g(精确至0.1mg,约含脂肪100mg~200mg)移入到250mL平底烧瓶中
Ø 加入约100mg焦性没食子酸,加入几粒沸石,再加入2mL95%乙醇,混匀，根据试样的类别选取不同的水解方法。
• 11.2.2 试样的水解
Ø 操作步骤同4.2.1.2
• 11.2.3 脂肪提取
Ø 操作步骤同4.2.1.3
• 11.2.4 脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化
Ø 操作步骤同4.2.1.4
• 11.2.5 色谱测定
Ø 色谱参考条件同4.3.1
• 11.3 酯交换法
• 11.3.1 试样称取
Ø 称取试样60.0mg至具塞试管中,精确至0.1mg；
• 11.3.2 甲酯制备
Ø 同4.2.2.2
三、仪器及材料
1．气相色谱仪GC 7900（AFC） （南京科捷检测）
氢焰检测器（FID）
气源： 氮气，氢气，空气。
2．数据处理：N2000工作站及电脑
3．色谱柱：毛细管专用柱 。
4．分析级：乙醚，正己烷，甲醇，kOH（NaOH），蒸馏水
5．10ml容量瓶
GC 7900（AFC） 气相色谱仪
GC 7900 气相色谱仪，拥有成熟稳定的技术 , 主要应用于环境科学、食品安全、石油化工、精细化工、电子高纯气体 等行业，适用于科研院所、质检、安监、公安法医和国家安全等领域的分析检测。
性能特点：
● 高精度气体流量控制系统（AFC）
1·采用 AFC 数字化控制技术，自动化水平和整体性能接近国际一线品牌
2·高精度气体流量控制，确保 GC 分析的准确度，提高日常分析效率，AFC 控制精度 0.01psi
3·实现了气路故障自我保护、自动点火、熄火重点、自动开启气路等功能，从而达到了一键启动
4·多种控制组合模式操作，压力流量全自动调节、控制和显示，可运行省气模式
● 彩色宽屏，触摸按键的独特设计
1·采用 7 寸工业彩色液晶屏设计，显示信息更全，界面操作更合理
2·具有中 / 英文两套操作系统，满足不同的用户需求
3·采用电阻式触摸屏，手感好、经久耐用、屏幕和软件双操作实现无缝连接
● 领先的结构设计
1·模块化的结构设计，便于升级。可选配多种高性能检测器，如 FID、TCD、ECD、FPD 和 NPD 等，满足多种类样品的 分析需求
2·先进的进样器设计，独特的内衬管结构和特殊处理工艺，确保样品零吸附
3·适配多种进样方式，顶空进样器、热解析仪、液体自动进样器，轻松胜任各种样品类型的分析
4·设计定时自启动程序，可轻松的完成气体、液体样品的实验室在线分析
● 极具用户体验的软件操作系统
1·采用先进的 10/100M 自适用以太网通信接口，内置 IP 协议，轻松组成局域网，实现远距离传输、远程控制、远程诊断
2·界面简单，数据处理功能强大，实现了 GC 整套分析管理工作的严谨和高效自动化
3·配备 IBrainChrom 工作站，可支持多台色谱仪（253 台）同时工作，实现数据处理及反控
关于南京科捷
南京科捷检测科技发展有限公司作为实验室色谱领域的知名企业，在近 20年的技术创新历史中，一直致力于帮助科学家和实验室分析人员解决复杂的分析问题。
我们为科学家和实验室分析人员在 GC、GCMS、LC、AAS、ICP、UV 等领域提供方案，并在其日常检测中提供技术支持，经过20年的沉淀与积累，逐渐赢得客户信赖。
南京科捷检测专注于食品安全、环境卫生和能源化工等领域，为行业提供方案，为客户提供信心，让人们的生活更美好是我们始终坚信的使命。
南京科捷仪器售后派专业技术人员免费对设备进行安装、启动和调试，负责对用户实验人员进行专业仪器技术培训，实行“交钥匙” 工程，欢迎广大客户来电咨询：400-800-6210
